Тщательная характеристика плюрипотентности является обязательной процедурой, при получении свежевыделенных эмбриональных или индуцированных клеточных линий плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). Однако, не менее важно проводить контроль созданных клеточных линий с целью выявления признаков спонтанной дифференцировки.  Контроль плюрипотентности и состояние дифференцированности культуры (PSC) обычно проводится методом иммунофлюоресцентной микроскопии. Однако, данный метод весьма кропотлив и не позволяет провести надежную количественную оценку клеточных популяций.

Несмотря на все свои возможности, метод проточной цитометрии довольно редко применяется в исследованиях стволовых клеток. В данном обзоре представлен протокол для многоцветного цитометрического анализа, который позволяет количественно определять внутриклеточные и поверхностные маркеры одновременно, для обеспечения легкого мониторинга плюрипотентного статуса человеческой культуры PSC.

Клеточные линии

Человеческие PSC культивировались в среде StemMACS™ iPS-Brew XF, human (#130-104-368) в лунках 6-луночного культурального планшета, лунки которого покрыты Matrigel® hESC-Qualified Matrix. Для того, чтобы подтвердить, что методом проточной цитометрии можно обнаружить потерю плирипотентности стволовых клеток, были также проанализированы hiPSCs, дифференцированные в нейрональную линию. Клеточные линии плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных стволовых клеток были обработаны  0.05% раствором trypsin/EDTA для получения «single cells» клеточной суспензии, пригодной для цитомтерического анализа.

Проточный цитометрический анализ

Окрашивание клеток антителами

Панель для анализа PSCs включает антитела как для поверхностных, так и для внутриклеточных маркеров. На первом этапе окрашиваются поверхностные маркеры. Затем, клетки фиксируются и пермеабилизируются для внутриклеточного окрашивания.

Для того, чтобы настроить прибор и провести компенсацию флюоресценции обязательно необходимо подготовить контрольные образцы с одиночной окраской каждым антителом и также неокрашенный контрольный образец, который культивировался и подвергался таким же процедурам, что и остальные образцы. В таблице 2 приведена схема пробоподготовки для настройки прибора и компенсации флюоресценции.

На заметку: Fluorescence-minus-one (FMO) контроль может быть очень полезен для более точного определения гейтов. FMO-контроль содержит все антитела, кроме одного.

Методика окрашивания:

1. Определить количество клеток. Использовать для анализа  1×10⁶ iPS-клеток.
2. Центрифугировать клеточную суспензию при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
3. Ресуспендировать образец 1 в  77.8 μL буфера. Это будет образец, окрашенный всей панелью антител.
4. Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера. Это будут: неокрашенный контроль и одиночно окрашенные контрольные образцы.
5. Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения поверхностных маркеров:  Anti-TRA-1-60-PE, ii) Anti-SSEA-4-VioGreen™, and iii) Anti-SSEA-5-VioBlue®. Add 2.2 µL of Anti-SSEA-1-PE-Vio 770.
6. Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 3-5 для определения поверхностных маркеров.
7. Не добавляйте антитела в образцы 2,6,7 на данном этапе.
8. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 10 мин в темноте при 2-8 °C.
   На заметку: высокая температура или длительная инкубация могут привести к неспецифическому мечению клеток антителами.
9. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
10. Ресуспендировать все образцы в 100 μL буфера. Добавьте по 100 μL раствора для фиксации (Inside Fix, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
11. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темноте.
12. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
13. Ресуспендировать образец 1 в 90 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации (Inside Perm, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
14. Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации.
15. Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения внутриклеточных маркеров:  i) Anti-Sox2-FITC, and ii) Anti-Oct3/4 Isoform A-APC.
16. Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 6 и 7 для определения внутриклеточных маркеров.
17. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темноте.
18. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
19. Ресуспендировать осадок клеток в удобном для анализа объеме буфера для проточной цитометрии. Рекомендованный объем — 1 мл.
    На заметку: Фиксированные и пермеабилизированные клетки имеют меньший размер, по сравнению с живыми клетками. Поэтому настройки FSC/SSC скорее всего придется отрегулировать.

Настройка прибора

1. Установите параметры светорассеяния и напряжения по всем каналам, а также установите триггер в соответствии с образцом 2 (неокрашенный контроль) (рис.1а).
2. Используйте одиночно-окрашенные образцы 3-7 для корректировки компенсации (рис.1b).
3. Для настройки канала  PE-Vio 770 используйте Comp Beads (Miltenyi Biotec) (рис.1c).

Изотипические контроли

Изотипические контроли используются для проверки и отсечения неспецифического связывания различный флюорохром-конъюгированных антител с клетками. Пример окрашивания изотипическими контролями приведен на рис. 2.

Результаты

Приведенная в данной методике панель антител предназначена для окрашивания поверхностных и внутриклеточных маркеров и позволяет оценивать плюрипотентность стволовых клеток. На рисунке 3а приведены результаты фенотипирования человеческих hiPSC. Такие маркеры плюрипотентности, как: SSEA-4, SSEA-5, TRA-1-60, Sox-2 и Oct 3/4 экспрессируются на высоком уровне у hiPSC клеток, тогда как маркер дифференцировки SSEA-1 экспрессируется незначительно.

Напротив, клетки дифференцированные в нейронную линию экспрессируют выраженные маркеры плюрипотентности на низком уровне, или даже выключили экспрессию маркеров плюрипотентности, однако, экспрессия маркера дифференцировки SSEA-1 (рис. 3B) ярко выражена на этих клетках. Экспрессия маркера Sox2  также ярко выражена, что подтверждает дифференцировку hiPSC в клетки нейронных предшественников (рис. 3B).

В качестве контроля дифференцировки мы окрасили еще один образец антителами к маркерам PSA-NCAM и Pax6, которые являются маркерами нейронов и нейронных предшественников соответственно. Как и следовало ожидать, большинство дифференцированных клеток (80%) ко-экспрессировали оба этих маркера.

Заключение

Панель антител, описанная в данном обзоре обеспечивает надежный контроль состояния плюрипотентности PSC методом многоцветной проточной цитометрии. Процедура быстрая и подходит для выполнения рутинного мониторинга. Внутриклеточный и поверхностные отметки исследуются одновременно.