+7-495-781-17-87

Звоните пн-пт с 9:00 до 18:00

Многоцветный цитометрический анализ культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Тщательная характеристика плюрипотентности является обязательной процедурой, при получении свежевыделенных эмбриональных или индуцированных клеточных линий плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). Однако, не менее важно проводить контроль созданных клеточных линий с целью выявления признаков спонтанной дифференцировки.  Контроль плюрипотентности и состояние дифференцированности культуры (PSC) обычно проводится методом иммунофлюоресцентной микроскопии. Однако, данный метод весьма кропотлив и не позволяет провести надежную количественную оценку клеточных популяций.

Несмотря на все свои возможности, метод проточной цитометрии довольно редко применяется в исследованиях стволовых клеток. В данном обзоре представлен протокол для многоцветного цитометрического анализа, который позволяет количественно определять внутриклеточные и поверхностные маркеры одновременно, для обеспечения легкого мониторинга плюрипотентного статуса человеческой культуры PSC.

Клеточные линии

Человеческие PSC культивировались в среде StemMACS™ iPS-Brew XF, human (#130-104-368) в лунках 6-луночного культурального планшета, лунки которого покрыты Matrigel® hESC-Qualified Matrix. Для того, чтобы подтвердить, что методом проточной цитометрии можно обнаружить потерю плирипотентности стволовых клеток, были также проанализированы hiPSCs, дифференцированные в нейрональную линию. Клеточные линии плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных стволовых клеток были обработаны  0.05% раствором trypsin/EDTA для получения «single cells» клеточной суспензии, пригодной для цитомтерического анализа.

Проточный цитометрический анализ

Окрашивание клеток антителами

Панель для анализа PSCs включает антитела как для поверхностных, так и для внутриклеточных маркеров. На первом этапе окрашиваются поверхностные маркеры. Затем, клетки фиксируются и пермеабилизируются для внутриклеточного окрашивания.

Для того, чтобы настроить прибор и провести компенсацию флюоресценции обязательно необходимо подготовить контрольные образцы с одиночной окраской каждым антителом и также неокрашенный контрольный образец, который культивировался и подвергался таким же процедурам, что и остальные образцы. В таблице 2 приведена схема пробоподготовки для настройки прибора и компенсации флюоресценции.

На заметку: Fluorescence-minus-one (FMO) контроль может быть очень полезен для более точного определения гейтов. FMO-контроль содержит все антитела, кроме одного.

Методика окрашивания:

  1. Определить количество клеток. Использовать для анализа  1×10⁶ iPS-клеток.
  2. Центрифугировать клеточную суспензию при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
  3. Ресуспендировать образец 1 в  77.8 μL буфера. Это будет образец, окрашенный всей панелью антител.
  4. Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера. Это будут: неокрашенный контроль и одиночно окрашенные контрольные образцы.
  5. Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения поверхностных маркеров:  Anti-TRA-1-60-PE, ii) Anti-SSEA-4-VioGreen™, and iii) Anti-SSEA-5-VioBlue®. Add 2.2 µL of Anti-SSEA-1-PE-Vio 770.
  6. Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 3-5 для определения поверхностных маркеров.
  7. Не добавляйте антитела в образцы 2,6,7 на данном этапе.
  8. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 10 мин в темноте при 2-8 °C.
    На заметку: высокая температура или длительная инкубация могут привести к неспецифическому мечению клеток антителами.
  9. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
  10. Ресуспендировать все образцы в 100 μL буфера. Добавьте по 100 μL раствора для фиксации (Inside Fix, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
  11. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темноте.
  12. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
  13. Ресуспендировать образец 1 в 90 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации (Inside Perm, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
  14. Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации.
  15. Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения внутриклеточных маркеров:  i) Anti-Sox2-FITC, and ii) Anti-Oct3/4 Isoform A-APC.
  16. Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 6 и 7 для определения внутриклеточных маркеров.
  17. Тщательно перемешать образцы и инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темноте.
  18. Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
  19. Ресуспендировать осадок клеток в удобном для анализа объеме буфера для проточной цитометрии. Рекомендованный объем — 1 мл.
    На заметку: Фиксированные и пермеабилизированные клетки имеют меньший размер, по сравнению с живыми клетками. Поэтому настройки FSC/SSC скорее всего придется отрегулировать.

Настройка прибора

  1. Установите параметры светорассеяния и напряжения по всем каналам, а также установите триггер в соответствии с образцом 2 (неокрашенный контроль) (рис.1а).
  2. Используйте одиночно-окрашенные образцы 3-7 для корректировки компенсации (рис.1b).
  3. Для настройки канала  PE-Vio 770 используйте Comp Beads (Miltenyi Biotec) (рис.1c).

Изотипические контроли

Изотипические контроли используются для проверки и отсечения неспецифического связывания различный флюорохром-конъюгированных антител с клетками. Пример окрашивания изотипическими контролями приведен на рис. 2.

Результаты

Приведенная в данной методике панель антител предназначена для окрашивания поверхностных и внутриклеточных маркеров и позволяет оценивать плюрипотентность стволовых клеток. На рисунке 3а приведены результаты фенотипирования человеческих hiPSC. Такие маркеры плюрипотентности, как: SSEA-4, SSEA-5, TRA-1-60, Sox-2 и Oct 3/4 экспрессируются на высоком уровне у hiPSC клеток, тогда как маркер дифференцировки SSEA-1 экспрессируется незначительно.

Напротив, клетки дифференцированные в нейронную линию экспрессируют выраженные маркеры плюрипотентности на низком уровне, или даже выключили экспрессию маркеров плюрипотентности, однако, экспрессия маркера дифференцировки SSEA-1 (рис. 3B) ярко выражена на этих клетках. Экспрессия маркера Sox2  также ярко выражена, что подтверждает дифференцировку hiPSC в клетки нейронных предшественников (рис. 3B).

В качестве контроля дифференцировки мы окрасили еще один образец антителами к маркерам PSA-NCAM и Pax6, которые являются маркерами нейронов и нейронных предшественников соответственно. Как и следовало ожидать, большинство дифференцированных клеток (80%) ко-экспрессировали оба этих маркера.

Заключение

Панель антител, описанная в данном обзоре обеспечивает надежный контроль состояния плюрипотентности PSC методом многоцветной проточной цитометрии. Процедура быстрая и подходит для выполнения рутинного мониторинга. Внутриклеточный и поверхностные отметки исследуются одновременно.

snc1571571
Комментариев нет
Категории:
Новости
Комментарии
Пока нет ни одного отзыва.
Написать комментарий
Ваш комментарий
Имя
Email
Все результаты поиска

Заявка

на покупку товара

Заявка

На бесплатное тестирование товара

Заявка

На уточнение стоимости товара

×