+7-495-781-17-87

Звоните пн-пт с 9:00 до 18:00

Субпопуляционный состав лейкоцитов крови и ее продуктов

Периферическая кровь или цельная кровь содержит различные клетки крови, такие как эритроциты (красные кровяные клетки), лейкоциты (белые кровяные клетки) и тромбоциты, взвешенные в плазме крови. Плазма состоит в основном из воды, но также содержит белки, глюкозу, ионы, гормоны и факторы свертывания крови. Удаление факторов свертывания из плазмы приводит к образованию сыворотки крови.

Наиболее распространенными клетками в крови являются эритроциты, в состав которых входит гемоглобин, железосодержащий белок. Гемоглобин обратимо связывает кислород и тем самым облегчает его транспортировку по организму.

Тромбоциты играют важную роль в восстановлении ран, так как они останавливают кровотечение путем слипания и свертывания крови в сосудах. Тромбоциты млекопитающих не имеют ядра. Они состоят из участков цитоплазмы, которые получают из мегакариоцитов в костном мозге до поступления в кровообращение. Примерно 25-40% тромбоцитов находятся в селезенке и высвобождаются по мере необходимости, а остальные свободно циркулируют в крови около десяти дней.

Наконец, различные подтипы лейкоцитов играют существенную роль в иммунном ответе.

Все клеточные компоненты крови происходят из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Эти плюрипотентные клетки располагаются в костном мозге и дают начало специализированным клеткам-предшественникам с более ограниченным потенциалом: лимфоидным клеткам-предшественникам и миелоидным клеткам-предшественникам. В свою очередь лимфоидные клетки-предшественники дают начало Т-и В-лимфоцитам, а также и естественным киллерам (NK-клеткам), тогда как миелоидные клетки-предшественники дают начало моноцитам, дендритным клеткам и гранулоцитам (включая нейтрофилы, базофилы и эозинофилы). Наконец, эритроциты и тромбоцит-продуцирующие мегакариоциты, происходят от их общего предшественника.

1 Лейкоциты

Лейкоциты играют ключевую роль в иммунном ответе и поэтому представляют особый интерес для понимания механизмов баланса здоровья и болезни. Для проведения исследований часто требуется проводить выделение лейкоцитов из крови или ее продуктов. Классификация лейкоцитов может быть основана на их происхождении (миелоидные или лимфоидные) или на морфологии их ядра (мононуклеарные или полинуклеарные) и наличии или отсутствии гранул в их цитоплазме, что разделяет лейкоциты на две группы: 1) мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs, также известные как агранулоциты) и 2) полиморфноядерные лейкоциты (PMNs, также известные как гранулоциты).

1.1 Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs)

PBMCs включают лимфоциты (Т, В и NK-клетки), моноциты и дендритные клетки. Т-и В-лимфоциты отличаются местом своего созревания и антигенными рецепторами. Т-клетки созревают в тимусе и экспрессируют Т-клеточный рецептор TCR, тогда как В-клетки созревают в костном мозге и несут В-клеточный рецептор BCR.

Т-клетки являются CD3+ и далее классифицируются на хелперные Т-клетки (Th), экспрессирующие CD4, и цитотоксические Т-клетки (Tcyt), экспрессирующие CD8. В-клетки характеризуются экспрессией молекулы CD19 и реагируют на патогены, производя большое количество антигенспецифических антител для нейтрализации чужеродных объектов, таких как бактерии и вирусы, а также опсонизируют (маркируют) их для дальнейшего распознавания другими иммунными клетками. NK-клетки являются CD56+CD3-и происходят из тех же клеток-предшественников, что и Т-и В-клетки, но не имеют антигенных рецепторов. Наконец, моноциты являются самым крупным типом PBMCs и экспрессируют молекулу CD14 на своей поверхности. Они циркулируют в кровотоке в течение 1-3 дней, а затем обычно перемещаются в ткани по всему телу, где они могут дифференцироваться в макрофаги и миелоидные дендритные клетки.
Различные субпопуляции PBMCs

Тип клеток

% от PBMCs
(вариабельность по здоровым донорам)
 
Маркеры

Функция

CD4+ T клетки25–60%CD3+CD4+Координируют адаптивный иммунитет через активацию и регуляцию других иммунных клеток
CD8+ T клетки5–30%CD3+CD8+Уничтожают раковые клетки, инфицированные или поврежденные клетки
B клетки5–10%CD19+Секретируют антитела как часть гуморального иммунного ответа
NK клетки10–30%CD56CD3Вызвают лизис или апоптоз инфицированных клеток
Моноциты5–10%CD14+Захватывают чужеродные объекты посредством фагоцитоза, выполняют презентацию антигена и продуцируют цитокины
Дендритные клетки1–2%Процессинг и презентация антигенного материала Т-клеткам

1.2 Гранулоциты

Гранулоциты характеризуются наличием гранул в их цитоплазме и переменной формой ядра; отсюда и название — полиморфноядерные лейкоциты (PNMs). Нейтрофилы, эозинофилы и базофилы — это все гранулоциты, которые при активации высвобождают содержимое своих гранул. Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами крови и первыми реагируют на очаг воспаления, где они выполняют свою фагоцитарную функцию. Считается, что эозинофилы (также известные как ацидофилы) участвуют в нападении на многоклеточных паразитов, таких как черви. Базофилы связаны со многими специфическими воспалительными реакциями, особенно теми, которые вызывают аллергические симптомы. Базофилы содержат антикоагулянт гепарин, который препятствует слишком быстрому свертыванию крови, а также сосудорасширяющий гистамин, который способствует притоку крови к тканям.

2 Содержание лейкоцитов в крови и в продуктах крови

Наиболее часто используемый источник лейкоцитов-периферическая цельная кровь. Однако в качестве источников все чаще используются продукты крови, такие как лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат (Buffy Coat), лейкоциты из камеры системы удаления лейкоцитов (LRSC) и материал для лейкафереза, такой как Лейкопак (Leukopak®). Для некоторых направлений, например, исследования стволовых клеток, пуповинная кровь и костный мозг лучше подходят в качестве исходного материала. Количество и состав клеток различаются между кровью и различными продуктами крови. Поскольку к каждому прикладному или исследовательскому вопросу предъявляются особые требования в отношении количества и состава клеток, источник лейкоцитов должен быть выбран соответствующим образом.

Типы клеток, абсолютное количество, и встречаемость в цельной крови и ее продуктах

Цельная кровьBuffy coatLRSCЛейкопак®
ЭритроцитыАбсолютное кол-во 5×109  cells/mL4×1011 cells/buffy coat5×1010 cells/LRSC8×109 cells/половина Лейкопак®
По отношению к PBMCs2500400501.2
PBMCsАбсолютное кол-во2×106 cells/mL1×109 cells/buffy coat1×109 cells/LRSC 7×109 cells/половина Лейкопак®
По отношению к PBMCs1111
ЛейкоцитыАбсолютное кол-во5×106 cells/mL 2×109 cells/buffy coat1×109 cells/LRSC7×109 cells/половина Лейкопак®
По отношению к PBMCs2.5211

Средние частоты общего количества лейкоцитов в различных продуктах крови.

 

Цельная кровьBuffy coatLRSCЛейкопак®
Общие T клетки22.5±3.8%53.8±6.1%53.8±6.1%54.5±12.4%
CD4+ T клетки14.6±3.5%24.4±6.6%32.4±6.6%31.9±6.4%
CD8+ T клетки6.8±1.3%10.8±4.6%15.0±4.5%17.1±8.1%
B клетки5.2±2.3%7.2±2.4%11.3±3.3%12.5±4.6%
Моноциты8.4±1.3%10.7±2.8%20.3±5.7%19.1±7.1%
NK клетки4.4±2.4%4.1±2.4%10.2±4.0%7.7±3.0%
CD3+CD56клетки0.8±0.7%1.4±2.1%1.8±1.3%4.3±7.1%
Эозинофилы3.2±1.6%1.3±0.8%1.9±2.3%1.1±0.9%
Нейтрофилы53.8±6.1%34.4±11.4%2.9±1.7%3.9±3.4%

Частоты (% популяции) клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием 7-цветного набора для Иммунофенотипирования клеток человека; количество лейкоцитов и эритроцитов определяли на Sysmex ® XP-300. Цифры указывают на проценты ± стандартное отклонение (n ≥ 10).

2.1 Цельная кровь

Все основные популяции иммунных клеток можно обнаружить в наиболее естественном состоянии в свежеприготовленной периферической крови. Однако типичный образец цельной крови редко превышает 10 мл и часто может быть меньше, особенно если донором является ребенок. Большие объемы могут быть получены от здоровых доноров, но обычно на одно донорство берется не более 500 мл. Это значительно ограничивает частоту встречаемости редких клеток, которые могут быть выделены из цельной крови. Преимуществом цельной крови, как источника, является свежесть материала, что очень важно для работы с чувствительными клеточными популяциями, такими как, например, нейтрофилы.

Антикоагулянты обычно добавляются к крови для предотвращения свертывания. Гепарин, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и цитрат являются одними из наиболее часто используемых добавок. Гепарин связывается с ингибитором фермента антитромбином III (АТ), что приводит к конформационным изменениям внутри белка АТ и в конечном счете к его активации. Активированный АТ инактивирует тромбин, фактор Ха и другие протеазы, участвующие в свертывании крови. ЭДТА сильно и необратимо хелатирует двухвалентные катионы, такие как Са2+, тем самым предотвращая свертывание крови. Наконец, цитрат также используется для связывания Ca2+.

 

2.2 Лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат (Buffy coat)

Лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат или Buffy coat -это фракция образца крови, содержащая лейкоциты после удаления эритроцитов и плазмы. После донорства мешок с 450-мл крови центрифугируют, в результате чего получают три фракции: I) плазму (верхняя фракция), ii) Buffy coat (промежуточная фракция) и ii) эритроциты (нижняя фракция). Как правило, банки крови интересуются только плазмой и эритроцитами. Поэтому эти части извлекаются из кровяного мешка. Оставшийся материал – это и есть Buffy coat, состоящий из концентрированных лейкоцитов и тромбоцитов с уменьшенным количеством эритроцитов и гранулоцитов, объем которого колеблется в диапазоне от 30 до 80 мл. Легкодоступный лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат является популярным источником PBMCs для исследований.

2.3 Лейкоциты из камеры системы удаления лейкоцитов (LRSC)

LRSC, также известный как buffy cone, является побочной фракцией клеток в процессе тромбоцитарного фереза, при котором тромбоциты отделяются и собираются из взятой крови для последующего переливания пациентам с нарушениями, связанными с тромбоцитами. Отделенная фракция тромбоцитов все еще содержит лейкоциты, которые должны быть удалены до переливания тромбоцитов, чтобы предотвратить проблемы с отторжением. С этой целью лейкоциты отфильтровываются лейкоредукцией и собираются в специальной камере — LRSC. Таким образом, LRSC содержит высокую плотность лейкоцитов с низкой концентрацией нейтрофилов.

2.4 Leukopak®

Хорошим источником большого количества лейкоцитов являются коммерчески доступные Лейкопаки®. Это обогащенный продукт лейкафереза, собранный из периферической крови и состоящий из различных клеток крови, включая моноциты, лимфоциты и эритроциты. Соотношение лейкоцитов и эритроцитов низкое (в среднем 1:1), как и количество гранулоцитов. Коммерческие Лейкопаки® выпускаются в нескольких стандартных размерах, начиная от целого Лейкопака® до размеров ½ и ¼. Хотя количество PBMCs в Лейкопаке® является переменным, оно обычно остается в определенном диапазоне.

В некоторых случаях донорам вводят G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), чтобы индуцировать выработку лейкоцитов и вызвать миграцию стволовых клеток из костного мозга в кровь. Таким образом, мобилизованные Лейкопаки® имеют более высокое количество лейкоцитов по сравнению с иммобилизованными Лейкопаками®, и частоты различных подтипов PBMC также различаются. Большинство Лейкопаков® получают от здоровых доноров, но также можно запросить Лейкопакс® для некоторых заболеваний, таких как аллергия и диабет.

3 Пуповинная кровь как источник лейкоцитов

Пуповинная кровь остается в плаценте и пуповине после рождения и собирается для сохранения стволовых клеток, которые могут быть использованы при лечении гемопоэтических и генетических нарушений. Пуповинная кровь содержит все компоненты цельной крови, включая лейкоциты, а также богата CD34+ гемопоэтическими стволовыми клетками. Несмотря на то, что количество CD34+ клеток сильно варьируется от донора к донору, обычно можно собрать от 1 до 4 миллионов CD34+ клеток с одной пуповины. Пуповинная кровь все чаще используется на экспериментальной основе в качестве альтернативного источника стволовых клеток, которые в противном случае получают из костного мозга.

4 Костный мозг как ресурс лейкоцитов

Костный мозг (КМ) – это полутвердая ткань, расположенная в губчатых частях костей и являющаяся основным местом кроветворения. Помимо костномозговой жировой ткани и поддерживающих стромальных клеток, КМ содержит мезенхимальные (МСК) и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК). ГСК дают начало различным клеткам крови, включая лейкоциты. МСК дифференцируются в клетки скелетных тканей, включая клетки хрящей (хондроциты), костные клетки (остеобласты) и жировые клетки (адипоциты). Мононуклеарные клетки КМ, которые включают лейкоциты, а также стволовые и прогениторные клетки, можно отделить от эритроцитов и гранулоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности.

Скачать PDF: Isolation of mononuclear cells from human bone marrow aspirates by density gradient centrifugation (special protocol)

5 Пробоподготовка крови

Для выделения клеток-мишеней можно использовать непосредственно цельную кровь. Однако в некоторых случаях использование именно фракции PBMC в качестве стартового материала для выделения определенного типа клеток может быть более эффективным.  PBMCs могут быть получены из цельной крови путем центрифугирования в градиенте плотности или путем лизиса эритроцитов, хотя последний способ считается “быстрым и грязным” методом.

В наиболее распространенном методе центрифугирования, с использованием градиента плотности используется раствор высокомолекулярных полимеров сахарозы Ficoll Paque® (Фиколл). Образец крови центрифугируют в пробирке, содержащей фиколл, чтобы разделить его компоненты в соответствии с их плотностями. Эритроциты имеют более высокую плотность, чем плазма, и поэтому оседают в нижней части пробирки и могут составлять до 45% от общего объема (в крови от здоровых доноров). Этот процент объема известен как гематокрит. Лейкоциты и тромбоциты образуют узкий слой с кольцом непосредственно над эритроцитами. Как уже упоминалось ранее, этот слой называется Buffy coat или лейкоцитарно-тромбоцитарный слой.  Наконец, плазма составляет чуть менее 55% от общего объема и представляет собой бледно-желтую жидкость. Лейкоцитарно-тромбоцитарный слой содержит лимфоциты, моноциты и тромбоциты. Этот слой аккуратно собирается центрифугируется дважды в буферном солевом растворе, чтобы промыть PBMCs от градиента плотности и удалить тромбоциты. Полученные PBMCs могут быть использованы для дальнейшего выделения клеточных субпопуляций или других экспериментов.

Скачать PDF: Isolation of mononuclear cells from human peripheral blood by density gradient centrifugation (special protocol)

 

Все результаты поиска

Заявка

на покупку товара

Заявка

На бесплатное тестирование товара

Заявка

На уточнение стоимости товара

×