Флуоресцентный микроскоп стал важнейшим инструментом в современной биологии и медицине. Он позволяет детально исследовать динамические процессы на уровне молекулярных и клеточных структур, предоставляя специалистам высокоточные изображения изучаемых объектов.
Основные понятия
Флуоресценция относится к процессам люминесценции, при которых чувствительные молекулы испускают свет, находясь в электронно-возбужденных состояниях, создаваемых физическими или химическими механизмами.
В данном случае свечение становится следствием воздействия излучений ультрафиолетового или видимого спектра.
Флуоресцирующие молекулы называют флуорофорами. Поглощение и испускание фотонов веществом происходят почти одновременно. При более длительном временном интервале между этими процессами целесообразно говорить о явлении фосфоресценции.
Сфера использования
Высокочувствительные флуоресцентные микроскопы широко используются в медико-биологических областях. Они позволяют наблюдать за локализацией молекул и микроорганизмов, визуализировать и исследовать их специфические особенности.
При этом флуоресценция не оказывает мощного угнетающего действия на клетки, что облегчает мониторинг их внутренних динамических процессов.
Подобные микроскопы также применяются в материаловедении. Они помогают при анализе составов химических субстанций, обнаружении нежелательных вещественных вкраплений, выявлении дефектов поверхностей и решении прочих подобных задач.
Кратко о методе флуоресцентной микроскопии
Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.
Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.
Какие процессы участвуют
При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.
При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.
Формирование изображения
Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.
Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.
Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.
Подробно о конструкции и принципе работы микроскопа
Устройство разработано на базе традиционного оптического микроскопа, но имеет иной принцип работы. Исследуемый образец помечают люминесцирующими веществами, а затем с помощью сложной системы фильтров собирают испускаемые фотоны и визуализируют микрообъекты.
Устройство микроскопа
В основном прибор обладает всеми модулями, характерными для оптических микроскопов. Однако он, в отличие от них, оснащен флуоресцентным модулем.
Задачами данного технологического узла являются направление возбуждающего излучения на образец и последующее отделение отраженного света от общего потока. Для этого используется сложная система фильтров, объединенных в единый блок.
Также особенностью флуоресцентного микроскопа является тип осветителя. Оптические устройства в качестве источника света используют лампы накаливания с непрерывным спектром и максимумом в красной зоне.
Такие приборы плохо подходят для возбуждения флуоресцирующих красителей, поглощающих излучение в коротковолновом диапазоне. Вместо них применяют галогенные или светодиодные лампы.
Конструкция фильтров-блоков
В основе конструкции микроскопа лежит блок, включающий набор следующих оптических элементов:
- фильтра возбуждения;
- дихроичного светоделителя;
- эмиссионного фильтра.
Фильтр возбуждения принимает излучение от источника света, пропуская длины волн заранее установленного диапазона. Дихроичное зеркало сначала отражает фотоны через оптический объектив на образец, а затем направляет флуоресценцию к системе обнаружения. Далее на пути испускаемого излучения стоит эмиссионный фильтр, который блокирует нежелательные волны.
При установке фильтров важно обеспечить правильный угол наклона и ориентацию относительно светового пути, чтобы эффективно управлять фотонным потоком.
Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки.
Используемые осветители
В качестве источников света люминесцентные микроскопы чаще используют галогенные лампы. Они имеют небольшие размеры, хорошую цветопередачу и невысокую стоимость. Однако из-за низкой яркости и малого срока службы эти устройства постепенно вытесняются светодиодными LED-элементами.
Источники света на основе LED-технологии считаются самыми востребованными в современной микроскопии. Это универсальные полупроводниковые осветители, обладающие широким набором спектральных характеристик. Они позволяют использовать излучение в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней инфракрасной зоны.
Ранее в люминесцентной микроскопии широко применялись ртутные лампы высокого давления. Их использование запрещено российским законодательством с 2020 г.
Это надежные и непрерывно работающие установки, обладающие наиболее высокими значениями яркости по сравнению галогенными и светодиодными приборами.
Однако они имеют ряд существенных недостатков: малый срок службы, изменение спектральной характеристики с возрастом и продолжительные интервалы между выключением и включением.
.jpg)
Флуоресцентные камеры
Камера считается одним из важнейших и самых дорогих компонентов микроскопа. Она должна обладать высокой чувствительностью и низким уровнем шума, чтобы захватить как можно больше фотонов.
Для флуоресцентной визуализации предпочтительно монохромное устройство, которое обеспечивает одинаковое обнаружение сигналов на всех пикселях и увеличивает общую чувствительность.
Камера оснащается 1 из 2 типов матриц: прибором с зарядовой связью (CCD) или устройством на металл-оксид-полупроводниковых транзисторах (sCMOS).
Они преобразуют волновые сигналы в электрические заряды, которые поступают на усилитель, а затем передаются в аналогово-цифровой преобразователь.
В CCD-камерах все сигналы сканируются одновременно, что позволяет снизить уровень шума и повысить чувствительность. В sCMOS-устройствах считывание происходит произвольно, вследствие чего возникают нежелательные вибрации, искажается геометрия объектов при визуализации.
Выбор камеры зависит от типа исследуемых образцов, требуемой частоты кадров, угла обзора, разрешения и чувствительности. Например, для промышленных изысканий необходимы высокое качество изображений и скорость работы, а для медико-биологических исследований важнее чувствительность устройства.
Обозначения для фильтров
Производители разрабатывают собственные системы кодов для обозначения фильтров, используемых во флуоресцентной микроскопии, что нередко приводит к путанице в терминологии. Кодировка в основном отражает вещественный состав изделия или его функциональные свойства.
При маркировке фильтров возбуждения часто используют аббревиатуры UG и BG, обозначающие ультрафиолетовое и синее стекла соответственно.
Современные фильтры высокого разрешения с интерференционной оптикой многими производителями кодируются сокращением IF. На узкополосных моделях встречаются символы KP или SP.
Дихроичные светоделители маркируются следующими акронимами: DM — дихроичное зеркало, CBS — хроматический светоделитель, TK — щелевой делитель, FT — делитель цвета, RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения взаимозаменяемы.
Эмиссионные фильтры кодируются следующими символами: L или LP — широкополосный элемент, GG или Y — желтое стекло, OG или O — оранжевое стекло, RG или R — красное стекло, BA — запирающее стекло, K — щелевой фильтр.
Иногда наряду с акронимом присутствует числовое значение, указывающее на длину волны в нанометрах, на которой фильтр достигает половины величины максимальной пропускной способности.
Скорость обесцвечивания образцов
При исследовании микропрепаратов важно учитывать скорость процесса фотообесцвечивания — необратимого распада фоточувствительных молекул вследствие окисления их кислородом под воздействием светового потока высокой интенсивности.
Фотообесцвечивание неминуемо, но его скорость зависит от реакционной способности и окружения флуорофоров.
Для замедления процесса исследователи используют:
- специальные реагенты, способные менять фотофизические свойства флуорофоров посредством варьирования функциональных групп;
- фотостабильные красители;
- фильтры нейтральной плотности, уменьшающие количество фотонов, падающих на образец.
Кроме того, необходимо снижать интенсивность светового излучения и сокращать продолжительность волнового воздействия.
Иногда образец содержит собственные молекулы или органеллы, способные к люминесценции. Нередко они испускают волны той же длины, что и искусственно внедренные флуорофоры.
При визуализации сложно различать ожидаемые и эндогенные сигналы. В этом случае фотообесцвечивание может оказаться полезным. Образец подвергают длительному воздействию ультрафиолета для разрушения его собственных фоточувствительных компонентов. Затем в структуру изучаемого объекта внедряют флуоресцентные белки, с помощью которых осуществляют визуализацию.